Змијски отров садржи ензиме који хидролизују карбокси естарске везе.Супстрати за хидролизу су фосфолипиди, ацетилхолин и ароматични ацетат.Ови ензими укључују три врсте: фосфолипазу, ацетилхолинестеразу и ароматичну естеразу.Аргинин естераза у змијском отрову такође може да хидролизује синтетички аргинин или лизин, али углавном хидролизује протеинске пептидне везе у природи, па спада у протеазу.Ензими о којима се овде говори делују само на естарске супстрате и не могу да делују ни на једну пептидну везу.Међу овим ензимима, биолошке функције ацетилхолинестеразе и фосфолипазе су важније и потпуно су проучаване.Неки змијски отрови имају јаку активност ароматичне естеразе, која може да хидролизује п-нитрофенил етил естар, а- или П-нафтален ацетат и индол етил естар.Још увек није познато да ли ову активност производи независни ензим или познати нежељени ефекат карбоксилестеразе, а камоли њен биолошки значај.Када је отров Агкистродон халис Јапоницус реаговао са п-нитрофенил етил естром и индол етил естром, нису пронађени хидролизати п-нитрофенола и индол фенола;Напротив, ако ови естри реагују са змијским отровом подврсте Зхоусхан кобре и змијским отровом Бунгарус мултицинцтус, они ће брзо бити хидролизовани.Познато је да ови отрови кобре имају јаку активност холинестеразе, која може бити одговорна за хидролизу горе наведених супстрата.У ствари, Мцлеан ет ал.(1971) су известили да многи змијски отрови који припадају породици Кобра могу хидролизовати индол етил естар, нафтален етил естар и бутил нафтален естар.Ови змијски отрови потичу од: кобре, црновратне кобре, црне усне кобре, златне кобре, египатске кобре, краљевске кобре, златне кобре мамбе, црне мамбе и беле усне мамбе (Д. ав још увек познаје источну ромболу звечарку
Змијски отров може да хидролизује метил индол етил естар, који је супстрат за одређивање активности холинестеразе у серуму, али овај змијски отров не показује активност холинестеразе.Ово показује да у отрову кобре постоји непозната естераза, која се разликује од холинестеразе.Да би се разумела природа овог ензима, потребан је даљи рад на одвајању.
1、 Фосфолипаза А2
(И) Преглед
Фосфолипаза је ензим који може да хидролизује глицерил фосфат.У природи постоји 5 врста фосфолипазе, а то су фосфолипаза А2 и фосфолипаза
А., фосфолипаза Б, фосфолипаза Ц и фосфолипаза Д. Змијски отров углавном садржи фосфолипазу А2 (ПЛА2), неколико змијских отрова садржи фосфолипазу Б, а друге фосфолипазе се углавном налазе у животињским ткивима и бактеријама.Слика 3-11-4 показује место деловања ових фосфолипаза на хидролизу супстрата.
Међу фосфолипазама, ПЛА2 је више проучаван.То је можда највише проучаван ензим у змијском отрову.Његов супстрат је естарска веза на другој позицији Сн-3-глицерофосфата.Овај ензим се широко налази у змијском отрову, пчелињем отрову, отрову шкорпиона и животињским ткивима, а ПЛА2 има у изобиљу у четири фамилије змијских отрова.Пошто овај ензим разбија црвена крвна зрнца и изазива хемолизу, назива се и "хемолизин".Неки људи ПЛА2 називају и хемолитичком лецитиназом.
Лудееке је први открио да змијски отров може да произведе хемолитичко једињење делујући на лецитин путем ензима.Касније, Делезенне и др.доказао да када отров кобре делује на коњски серум или жуманце, формира хемолитичку супстанцу.Сада је познато да ПЛА2 може директно да делује на фосфолипиде мембране еритроцита, уништавајући структуру мембране еритроцита и изазивајући директну хемолизу;Такође може да делује на серум или на додат лецитин да би произвео хемолитички лецитин, који делује на црвена крвна зрнца и производи индиректну хемолизу.Иако ПЛА2 има у изобиљу у четири породице змијских отрова, садржај ензима у различитим змијским отровима је мало другачији.Звечарка (Ц
Змијски отров је показао само слабу активност ПЛА2.Табела 3-11-11 илуструје поређење ПЛА2 активности 10 главних отрова змија отровница у Кини.
Табела 3-11-11 Поређење активности фосфолипазе ВИИИ 10 змијских отрова у Кини
Змијски отров
Ослобађање масти
Алифатична киселина,
Цјумол/мг)
Хемолитичка активност ЦХУ50/^ г * мл)
Змијски отров
Отпустите масне киселине
(^раол/мг)
Хемолитичка активност “(ХУ50/фтг * 1111)
Најанаја атра
9. 62
Једанаест
Мицрацепхал опхис
пет поена један нула
калиспаллас
8. 68
две хиљаде осам стотина
грацилис
В, ацутус
7. 56
* * #
Опхиопхагус ханнах
три поен осам два
сто четрдесет
Бнугарус фасцтатус
7,56
двеста осамдесет
Б. мултицинцтус
један поен девет шест
двеста осамдесет
Випер а Русселли
седам тачка нула три
Т, мукроскваматус
један поен осам пет
Сиаменсис
Т. стејнегери
0. 97
（2） Одвајање и пречишћавање
Садржај ПЛА2 у змијском отрову је велики и стабилан је на топлоту, киселину, алкалије и денатурант, тако да је лако пречистити и одвојити ПЛА2.Уобичајена метода је да се прво изврши гел филтрација на сировом отрову, затим изврши хроматографија измене јона, а следећи корак се може поновити.Треба напоменути да лиофилизирање ПЛА2 након јоноизмењивачке хроматографије не би требало да изазове агрегацију, јер процес сушења замрзавањем често повећава јонску снагу у систему, што је важан фактор који узрокује агрегацију ПЛА2.Поред наведених општих метода, усвојене су и следеће методе: ① Веллс ет ал.② Супстратни аналог ПЛА2 је коришћен као лиганд за афинитетну хроматографију.Овај лиганд се може везати за ПЛА2 у змијском отрову са Ца2+.ЕДТА се углавном користи као елуент.Након што се Ца2+ уклони, афинитет између ПЛА2 и лиганда се смањује и он се може одвојити од лиганда.Други користе 30% органски раствор или 6мол/Л урее као елуент.③ Хидрофобна хроматографија је изведена са ПхеииилСепхар0СеЦЛ-4Б да би се уклонили трагови ПЛА2 у кардиотоксину.④ Анти ПЛА2 антитело је коришћено као лиганд за извођење афинитетне хроматографије на ПЛА2.
До сада је пречишћен велики број змијског отрова ПЛАЗ.Ту ет ал.(1977) навео је ПЛА2 пречишћен од змијског отрова пре 1975. Последњих година, велики број чланака о одвајању и пречишћавању ПЛА2 је објављен сваке године.Овде се фокусирамо на одвајање и пречишћавање ПЛА од стране кинеских научника.
Цхен Иуанцонг и др.(1981) издвојили су три врсте ПЛА2 из отрова Агкистродон халис Паллас у Зхејиангу, које се према њиховим изоелектричним тачкама могу поделити на киселе, неутралне и алкалне ПЛА2.Према својој токсичности, неутрални ПЛА2 је токсичнији, који је идентификован као пресинаптички неуротоксин Агкистродотоксин.Алкални ПЛА2 је мање токсичан, а кисели ПЛА2 скоро да нема токсичности.Ву Ксиангфу и др.(1984) упоредили су карактеристике три ПЛА2, укључујући молекулску тежину, састав аминокиселина, Н-терминал, изоелектричну тачку, термичку стабилност, активност ензима, токсичност и хемолитичку активност.Резултати су показали да су имали сличну молекуларну тежину и термичку стабилност, али да су имали значајне разлике у другим аспектима.Са аспекта активности ензима, активност киселог ензима била је већа од активности алкалног ензима;Хемолитички ефекат алкалног ензима био је најјачи на црвена крвна зрнца пацова, затим неутрални ензим, а кисели ензим једва хемолизован.Стога се спекулише да је хемолитички ефекат ПЛАЗ-а повезан са наелектрисањем молекула ПЛА2.Зханг Јингканг и др.(1981) су направили кристале агкистродотоксина.Ту Гуанглианг и др.(1983) је известио да је токсични ПЛА са изоелектричном тачком 7,6 изолован и пречишћен из отрова Випера ротундус из Фуџијана, и његове физичке и хемијске особине, састав амино киселина и секвенца од 22 аминокиселинска остатка на Н -терминала су утврђени.Ли Иуесхенг и др.(1985) изоловали су и пречистили још један ПЛА2 из отрова Випер ротундус у Фуџијану.Подјединица ПЛА2 * је 13 800, изоелектрична тачка је 10,4, а специфична активност је 35/книоИ/мири мг。 Уз лецитин као супстрат, оптимални пХ ензима је 8,0, а оптимална температура је 65 ° Ц. ЛД5 убризган интравенозно код мишева.То је 0,5 ± 0,12 мг/кг.Овај ензим има очигледне антикоагулантне и хемолитичке ефекте.Токсични ПЛА2 молекул се састоји од 123 остатка 18 врста аминокиселина.Молекул је богат цистеином (14), аспарагинском киселином (14) и глицином (12), али садржи само један метионин, а његов Н-терминал је остатак серина.У поређењу са ПЛА2 који је изоловао Тугуанг, молекулска тежина и број аминокиселинских остатака два изоензима су веома слични, а састав аминокиселина је такође веома сличан, али је број остатака аспарагинске киселине и пролина нешто другачији.Отров змије краљевске кобре Гуангки садржи богат ПЛА2.Шу Јујан и др.(1989) изоловао је ПЛА2 из отрова, који има специфичну активност 3,6 пута већу од оригиналног отрова, молекулску тежину од 13000, састав од 122 аминокиселинска остатка, изоелектричну тачку од 8,9 и добру термичку стабилност.Из посматрања ефекта базичног ПЛА2 на црвена крвна зрнца под електронским микроскопом, може се видети да он има очигледан ефекат на мембрану људских црвених крвних зрнаца, али нема очигледан ефекат на црвена крвна зрнца козе.Овај ПЛА2 има очигледан ефекат успоравања на електрофоретску брзину црвених крвних зрнаца код људи, коза, зечева и замораца.Цхен ет ал.Овај ензим може инхибирати агрегацију тромбоцита изазвану АДП, колагеном и натријум арахидонском киселином.Када је концентрација ПЛА2 10/кг/мл~100југ/мл, агрегација тромбоцита је потпуно инхибирана.Ако су испране тромбоците коришћене као материјал, ПЛА2 не би могао да инхибира агрегацију при концентрацији од 20 Мг/мл.Аспирин је инхибитор циклооксигеназе, који може инхибирати ефекат ПЛА2 на тромбоците.ПЛА2 може инхибирати агрегацију тромбоцита хидролизом арахидонске киселине да би се синтетизовао тромбоксан А2.Конформација раствора ПЛА2 произведеног отровом Агкистродон халис Паллас у провинцији Џеђијанг проучавана је помоћу кружног дихроизма, флуоресценције и УВ апсорпције.Експериментални резултати су показали да је конформација главног ланца овог ензима слична оној исте врсте ензима из других врста и родова, конформација скелета је имала добру топлотну отпорност, а структурна промена у киселој средини је реверзибилна.Комбинација активатора Ца2+ и ензима не утиче на окружење остатака триптофана, док инхибитор Зн2+ чини супротно.Начин на који пХ вредност раствора утиче на активност ензима се разликује од горе наведених реагенаса.
У процесу ПЛА2 пречишћавања змијског отрова, очигледан феномен је да змијски отров садржи два или више ПЛА2 елуационих врхова.Овај феномен се може објаснити на следећи начин: ① због постојања изоензима;② Једна врста ПЛА2 се полимеризује у различите ПЛА2 смеше са различитим молекулским тежинама, од којих је већина у опсегу од 9 000~40 000;③ Комбинација ПЛА2 и других компоненти змијског отрова компликује ПЛА2;④ Пошто је амидна веза у ПЛА2 хидролизована, наелектрисање се мења.① И ② су уобичајени, са само неколико изузетака, као што је ПЛА2 у ЦрВа/в змијском отрову
Постоје две ситуације: ① и ②.Трећи услов је пронађен у ПЛА2 у отрову следећих змија: Окиранус сцутеллатус, Парадемансиа мицролепидота, Ботхропс а ^>ер, Палестинска змија, пешчана змија и страшна звечарка км。
Резултат случаја ④ мења брзину миграције ПЛА2 током електрофорезе, али се састав аминокиселина не мења.Пептиди се могу разбити хидролизом, али генерално су и даље повезани дисулфидним везама.Отров звечарке источне јаме садржи два облика ПЛА2, који се називају тип а и тип п ПЛА2.Разлика између ова два типа ПЛА2 је само једна аминокиселина, односно глутамин у једном ПЛА2 молекулу је замењен глутаминском киселином у другом ПЛА2 молекулу.Иако тачан разлог за ову разлику није јасан, генерално се верује да је повезана са деаминацијом ПЛА2.Ако се ПЛА2 у отрову палестинске змије одржава топлим са сировим отровом, крајње групе у његовим молекулима ензима ће постати више него раније.Од Ц ПЛА2 изолован из змијског отрова има два различита Н-терминала, а његова молекулска тежина је 30000. Овај феномен може бити узрокован асиметричним димером ПЛА2, који је сличан симетричном димеру који формира ПЛА2 у отрову источне дијамантске звечарке. и западна дијамантска звечарка.Азијска кобра се састоји од многих подврста, од којих неке нису баш одређене у класификацији.На пример, оно што се некада звало подврста Цобра Оутер Цаспиан сада је препозната
Треба га приписати кобри спољашњег Каспијског мора.Како постоји много подврста и оне су помешане заједно, састав змијског отрова увелико варира због различитих извора, а такође је висок и садржај ПЛА2 изоензима.На пример, отров кобре
Најмање 9 врста ПЛА2 изоензима р ^ лл врста је пронађено у, а 7 врста ПЛА2 изоензима пронађено је у отрову кобре подврсте Цаспиан.Дуркин ет ал.(1981) проучавали су садржај ПЛА2 и број изозима у различитим змијским отровима, укључујући 18 отрова кобре, 3 отрова мамбе, 5 отрова змије, 16 отрова звечарке и 3 отрова морске змије.Генерално, ПЛА2 активност отрова кобре је висока, са много изозима.ПЛА2 активност и изозими отрова змије су средње.ПЛА2 активност отрова мамбе и отрова звечарке је веома ниска или нема ПЛА2 активности.ПЛА2 активност отрова морске змије је такође ниска.
Последњих година није пријављено да ПЛА2 у змијском отрову постоји у облику активног димера, као што је источна ромбофора звечарка (Ц. змијски отров садржи тип а и тип П ПЛА2, од којих су оба састављена од две идентичне подјединице , а само димераза има
Активност.Схен ет ал.такође је предложио да је само димер ПЛА2 змијског отрова активни облик ензима.Проучавање просторне структуре такође доказује да ПЛА2 западне дијамантске звечарке постоји у облику димера.Риболовно једињење
Постоје два различита ПЛА ^ Еи и Е2 змијског отрова, у којима 仏 постоји у облику димера, димер је активан, а његов дисоцирани мономер је неактиван.Лу Јингхуа и др.(1980) даље су проучавали физичка и хемијска својства и кинетику реакције Е. Јаиантхија и сар.(1989) изоловао је основни ПЛА2 (ВРВПЛ-В) из отрова змије.Молекуларна тежина мономера ПЛА2 је 10000, који има смртоносне, антикоагулантне и едемске ефекте.Ензим може да полимеризује полимере различите молекулске тежине под условом ПХ 4,8, а степен полимеризације и молекулска тежина полимера се повећавају са повећањем температуре.Молекуларна тежина полимера генерисаног на 96 ° Ц је 53 100, а ПЛА2 активност овог полимера се повећава за два
Време поста: 18.11.2022